中药蟾酥的研究与应用蟾毒灵的抗癌作用3
中药蟾酥的研究与应用
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蟾酥的研究与应用
蟾毒灵的抗癌作用（3）
多年的研究包括我们自己的研究发现蟾酥中的各种有效成分具有突出的抗肿瘤作用。蟾酥中的蟾毒灵（BL）可有效诱导白血病、乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤及结肠癌等相关癌细胞的分化、凋亡等活动。之前的文章我们介绍了很多蟾毒灵抗癌机制。今天我们下面将对蟾毒灵的作用靶点研究，诱导DNA损伤和诱导细胞自噬相关机制作进一步阐述
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(八)蟾毒灵作用靶点研究
1.作用于细胞膜上的Na+-K+-ATPase
蟾毒灵的结构与洋地黄极其相似，均属强心类固醇药物，通过与Na+-K+-ATPaseα亚单位结合抑制Na+-K+-ATPase的活性，表现出洋地黄样免疫反应活性，收缩血管，升高血压等作用。研究者用罗丹明摄入原理，检测蟾毒灵诱导人单核白血病细胞THP-1、人成淋巴白血病细胞MOLT-3以及结肠腺癌细胞凋亡发生后，对细胞膜电位的影响，进而来推测其作用位点；蟾毒灵作用3小时，发现上述细胞的膜电位下降；荧光染料标记线粒体膜电位没有改变，处理至少6小时内未观察到细胞色素c的释放。HIB9细胞表达bcl-2之后能够抑制蟾毒灵诱导的凋亡，但上述细胞膜电位的改变仍然存在，这种膜电位的改变是由于蟾毒灵选择性抑制细胞膜上的Na+-K+-ATPase而引起的，并且该抑制作用于bcl-2蛋白的上游。
2.抑制拓扑异构酶II活性
拓扑异构酶II（topoisomeraseII，TopoII）广泛存在于生物体，是调节生物体双链DNA超螺旋解旋及重新聚合状态的相互切换的关键酶，与DNA复制以及染色体的凝集关系非常密切。TopoII抑制剂可以干扰DNA的合成，从而影响细胞增殖，其活性与TopoII含量密切相关。蟾毒灵能够选择性诱导白血病细胞株HL-60、MLl及U的分化和凋亡，显著抑制细胞内TopoII活性以及DNA的合成。
蟾毒灵处理人白血病细胞HL-60后，TopoIImRNA水平立即下降，随后拓扑异构酶IId和IIB的含量及活性均显著下降，18小时之后几乎检测不到；这些现象早于凋亡特征之一DNA断裂的发生；蟾毒灵诱导的细胞凋亡可能是通过抑制TopoII活性来实现的。蟾毒灵作用12小时后，能够将白血病细胞株MLl细胞周期阻滞于G2/M，TopoII活性也被明显抑制，同时蛋白激酶A及蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）的活性被抑制，edc2激酶及酪蛋白激酶II（CaseinkinaseII,CKII）的活性增加。另有研究者用蟾毒灵在无血清的环境下刺激U细胞，CKII从胞浆转位到胞核，同时伴随TopoII的激活；免疫共沉淀技术检测到CKII与TopoII的复合物在蟾毒灵处理后随即增加，持续到6小时达到最大量，凋亡的细胞在9到12小时被检测到。因此，蟾毒灵诱导的CKII从细胞浆转位到细胞核与胞核内的TopolIct形成复合物，并且磷酸化激活TopolIct，与后来凋亡的发生有着密切的关系。
也有研究者比较了蟾毒灵与TopoII催化抑制剂ICRF-的不同，利用重组中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞株DNA损伤修复缺陷细胞株EM9及具有良好修复能力的亲本细胞株AA8，发现两种药物都可以抑制细胞增殖且都能抑制TopoII的活性，ICRF-可诱导DNA及染色体的损伤，但蟾毒灵并不引起DNA及染色体的损伤。另研究证明ICRF-能够增加AA8和EM9姐妹染色单体互换的频率，然而蟾毒灵对两种细胞的染色单体互换频率都没有影响，进一步说明了两种托扑异构酶抑制剂的作用机制是不同的。
3.类固醇受体共激活剂
事实上，所有的转录因子都要与共激活剂相互作用，包括染色质重塑因子募集和基础转录复合物的相互作用。共激活因子包括类固醇受体共激活因子（steroidreceptorcoactivator,SRC）p家族SRC-1(NCOA1)、SRC-2（TIF2/
GRIP1/NCOA2）和SRC-3（AIB1/ACTR/NCOA3）。与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有关，可以作为新的化疗手段的候选分子靶标。蟾毒灵可以促进肿瘤细胞SRC-3蛋白的降解从而抑制细胞的增殖。
（九）诱导DNA损伤
DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation（替换）deletion（删除）insertion（插入）exonskipping（外显子跳跃）
DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，而且与RNA及蛋白质可以在细胞内大量合成不同，一般在一个原核细胞中只有一份DNA，在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对，如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到后代。所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗传稳定性之所在。
DNA损伤修复（repairofDNAdamage）在多种酶的作用下，生物细胞内的DNA分子受到损伤以后恢复结构的现象。DNA损伤修复的研究有助于了解基因突变的机制，衰老和癌变的原因，还可应用于环境致癌因子的检测。
蟾毒灵可以诱导DNA损伤和抑制DNA损伤的修复已有报道但是在肺癌中尚不详细，本研究通过彗星电泳和DNPI染色发现在NCI-Hcells蟾毒灵可以诱导DNA损伤，蟾毒灵还可以抑制DNA损伤修复相关基因的表达：比如DNA依赖性蛋白激酶（dependentserine/threonineproteinkinase,DNA-PK）,乳腺癌DNA修复蛋白1（DNArepairproteinsbreastcancer1，乳腺癌1号基因（BRCA1），14-3-3σ（一种重要的DDR检测点）和p53（肿瘤抑制蛋白）。
蟾毒灵可以活化p-p53，上调ATMandATR基因，这两个基因编码DDR的传感器蛋白，上调BRCA1andDNA-PK.基因表达，抑制p53and14-3-3σ基因表达，但是对MGMT基因的表达无明显影响。
（十）诱导细胞自噬
恶性神经胶质瘤是常见的神经系统原发肿瘤，预后较差。研究显示蟾毒灵可以通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，也可以通过上调内质网应激标志物CHOP和GRP78，倍增PERK、eIF2α，并引起caspase-4断裂，从而诱导内质网应激介导的凋亡。蟾毒灵可以诱导细胞自噬包括酸性自噬泡的形成，增加自噬小体和LC3-II的累积。进一步的研究表明蟾毒灵诱导自噬与ATP耗尽、活化型AMPK增加、mTOR磷酸化水平下降、及下游靶点4EBP1和p70S6K1表达水平下降有关。PERK/eIF2α/CHOP信号通路在此过程中发挥重要的作用。
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策划/殷佩浩
审校/殷佩浩
责任编辑/魏亦成
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