研究知母皂苷AIII抑制人脑胶质瘤
本文作者：上海中医药大学谭希、上海中医药大学吴伟达、上海中医药大学章丹丹；刊发于年3月第42卷第6期《中国中药杂志》
[摘要]考察知母皂苷AIII抑制人脑胶质瘤U87MG细胞增殖的作用及机制分析。在裸鼠皮下荷瘤模型中,知母皂苷AIII组与模型组相比,显著降低瘤重。知母皂苷AIII呈剂量依赖性抑制U87MG细胞的体外增殖;呈剂量依赖性降低βCatenin,CyclinD1,Bcl2的蛋白表达,同时升高p21在蛋白和基因水平的表达;降低ERK磷酸化水平,抑制βCatenin的核转移,同时提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平。联用JNK抑制剂SP和p38抑制剂SB后可逆转知母皂苷AIII处理而提高的p21和降低的βCatenin的蛋白表达。知母皂苷AIII部分通过干预MAPK及Wnt/βCatenin信号通路而抑制脑胶质瘤U87MG的增殖。
中药知母是百合科植物知母AnemarhenaasphodeloidesBge的干燥根茎,具有滋阴润燥、清热泻火等功效。其性寒,味苦,归肺、胃、肾经,临床用于外感热病、骨蒸潮热、肺热燥咳、高热烦渴等症状[1]。其主要药理活性成分知母皂苷在知母根茎中的质量分数约为6%[2]。国内外研究人员发现知母皂苷AIII能抑制ADP诱导的血小板聚集、诱导肿瘤细胞自噬等[34],近年来对于知母皂苷AIII抗肿瘤活性的研究日益深入[57],有希望将其开发成一种新的抗癌类药物。
脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)约占颅内肿瘤的70%。恶性脑胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第二位死亡原因,患者平均存活的中位时间是14个月。脑胶质瘤多呈侵袭性生长,总体疗效不佳,是神经外科治疗中最棘手的难治性肿瘤之一[]。目前尚未有知母皂苷AIII抑制脑胶质瘤增殖生长的相关报道。该文考察知母皂苷AIII体内外抑制脑胶质瘤增殖生长的作用并基于MAPK信号通路和Wnt/βCatenin信号通路考察其机制。
1.材料
1.1药物与试剂
知母皂苷AIII、淫羊藿苷II、红景天苷、原薯蓣皂苷元均购自上海同田生物技术股份有限公司;人脑恶性胶质瘤细胞株U87MG购自美国ATCC公司;DMEM干粉培养基、胎牛血清购自Gibco公司;二甲基亚砜、噻唑蓝购自西格玛奥德里奇(SigmaAldrich)公司;cDNA逆转录试剂盒、Trizol试剂购自赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific)公司;RealMasterMix(SYBRGren)试剂盒、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂PhosSTOP均购自美国Roche公司;引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。Marker预染蛋白购自Progema公司;NC膜购自英国沃特曼Whatman公司;一抗βactin,pERK,TERK,pp38,Tp38,pJNK,TJNK,βCatenin购自美国细胞生物技术(CelSignalingTechnology)公司;p21、CyclinD1抗体、二抗山羊抗鼠、二抗山羊抗兔均购自美国abCAM公司。ECL化学发光试剂盒购自美国通用公司生命技术科学部门(GE);BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA蛋白强裂解液、Bcl2抗体、HDAC1抗体、细胞核蛋白细胞浆蛋白抽提试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。
1.2仪器
生物安全柜(Deltaseries,Labconco,美国);CO2培养箱(HEPACLASS,Thermo,美国);细胞计数仪(XDSC,上海蔡康光学仪器有限公司);倒置显微镜(IX71,Olympus,日本);QB恒温微孔板快速振荡器(海门市其林贝尔仪器有限公司);荧光定量PCR仪(FastSystem,ApliedBiosystems公司,美国);超声波细胞粉碎机(JYD,宁波新芝生物股份有限公司);低温高速离心机(EpendorfCentrifuge5R,德国);电泳仪(PowerPacTMHC,BIORAD公司,美国);脱色摇床(TS8,KylinbellLabInstruments,中国);凝胶成像系统(TanonNIM,上海天能公司);SpectraMAX酶标仪(MD公司,美国)。
2.方法
2.1细胞培养
U87MG细胞培养于添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37°C恒温、5%CO2培养箱中饱和湿度的条件下培养。稳定传2~3代后,选择处于对数生长期细胞用于后续实验。
2.2建立裸鼠皮下移植瘤模型
在裸鼠左上肢腋下缓慢推注注射02mLU87MG细胞混悬液,含2×个细胞。定期观测裸鼠成瘤的时间和瘤体积大小。肿瘤的体积用游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)及最短径(b),并根据公式V=ab2/2进行计算。成瘤后,给予中药单体1mg·kg-1腹腔注射14d,取瘤称重,免疫组化检测Ki67。
2.3MTT法考察
知母皂苷AIII对U87MG脑胶质瘤细胞增殖能力的影响U87MG细胞悬液调节成密度为5×个/mL,每孔接种μL于96孔板中,在CO2培养箱中过夜。为考察知母皂苷AIII对U87MG细胞增殖能力的影响,预试验中设置24,48,72h时间点,数据差异不大(未显示),最终选择24h为MTT检测时间。知母皂苷AIII于,25,5,10μmol·L-1剂量处理U87细胞,孵育24h后,每孔加入5g·L-1MTT(1×PBS为溶剂)溶液20μL,继续避光培养4h,弃上清,每孔加入μLDMSO,37°C摇床振摇5~10min至其充分溶解,于酶标仪测得在nm波长下的吸光度A,计算用知母皂苷AIII不同浓度处理的各组细胞的细胞活性。细胞活性率=(A给药组-A空白对照组)/(A对照组-A空白对照组)×%。每组独立实验重复3次。
2.4QRTPCR考
察知母皂苷AIII对细胞凋亡信号通路中p21mRNA表达的影响为考察知母皂苷AIII对细胞周期的影响,检测其对细胞周期阻滞蛋白p21的表达的影响,文献报道知母皂苷AIII诱导白血病细胞凋亡时间为4h[11],预实验中比较了4,6,24h知母皂苷AIII诱导p21基因和蛋白表达变化(数据未显示),最终确定4h检测p21基因表达变化,6h检测蛋白表达变化。U87MG细胞贴壁过夜培养后,更换为新鲜的无血清DMEM培养液,给药处理组加入知母皂苷AIII(5,10μmol·L-1)继续培养4h,每组加1mLTrizol按照Trizol说明书提取步骤收集各组细胞的总RNA,读取和计算各组RNA浓度,加DEPC水将全部样品的RNA调整至同一质量浓度mg·L-1。A/A在18~20的样品进行逆转录。按照HighCapacity逆转录试剂盒说明书,20μL逆转录体系的反应条件为:25°C10min,37°Cmin,85°C5min,产物置于4°C备用。按照RealMasterMix(SYBRGren)说明书,以20μL反应体系合成模板cDNA,进行定量反转录聚合酶链式反应(QRTPCR)。引物序列如下:p21Forward5′TGAGCCGCGACTGTGATG3′;Reverse5′GTCTCGGTGACAAAGTCGAAGTT3′;βactinForward5′CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC3′;Reverse5′CGGACTCGTCATACTCCTGCT3′,由生工生物工程(上海)有限公司合成。反应条件为:95°C10min,50°C2min,95°C预变性15s,53°C1min,扩增40个循环。每组样品均做3个复孔。知母皂苷AIII处理组的相对含量用2ΔΔCt计算得出。每组独立实验重复3次。
2.5Westernblot考察
知母皂苷AIII及抑制剂联用对信号通路中关键蛋白表达含量的影响为考察知母皂苷AIII对MAPK信号通路的影响,而蛋白磷酸化水平随时间变化而变化,最终确定知母皂苷AIII(5,10μmol·L-1)处理30min后,收集蛋白检测MAPK主要蛋白的磷酸化水平。细胞分为空白对照组、抑制剂联用组为抑制剂联用预处理1h后加入知母皂苷AIII(5,10μmol·L-1)、抑制剂联用单独处理组、知母皂苷AIII(5,10μmol·L-1)单用组处理6h,冰镇1×PBS清洗,加入磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和RIPA强细胞裂解液后收集细胞,超声细胞粉碎机超声破碎(3次,3s/次),离心机在4°C以00r·min-1离心15min后取上清。根据细胞核蛋白细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书,对细胞核蛋白和浆蛋白进行分离。各组蛋白均用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。电泳前将每组15μg的蛋白以4∶1的比例加入5×loadingbufer,金属浴95°C2min后即用10%或12%的SDSPAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,用湿转法将蛋白转到NC膜上后,用5%脱脂牛奶或5%BSA溶液封闭1h,分别用一抗βactin,βCatenin,CyclinD1,p21,Bcl2,pERK,TERK,pp38,Tp38,pJNK,TJNK,4°C孵育过夜,用TBST洗膜5min,6次后加入相应二抗(1∶1万)孵育,TBST洗膜5min,6次后,ECL显影液显影。每组独立实验重复3次。
2.6统计分析
本实验所有计量资料均以x珋±s表示,两样本组间比较采用t检验,P为差异具有统计学意义。
3.结果
3.1知母皂苷AIII对裸鼠皮下荷瘤模型的影响与模型组比较,知母皂苷AIII处理组的瘤重呈显著性降低(P)。而淫羊藿苷II、红景天苷、原薯蓣皂苷元处理组的瘤重有一定的下降趋势,但无显著性差异(图1)。Ki67的表达与肿瘤细胞增殖密切相关,临床上Ki67作为评价恶性肿瘤细胞生长的重要指标。与模型组比较,知母皂苷AIII处理组的Ki67阳性细胞数显著减少(P)。其余组与模型组比较,无显著性差异(图1)。
3.2知母皂苷AIII对U87MG细胞增殖能力的影响不同剂量的知母皂苷AIII(~10μmol·L-1)和人脑胶质瘤细胞共孵育24h,知母皂苷AIII在25~10μmol·L-1呈剂量依赖性抑制人脑胶质瘤细胞U87MG的细胞增殖(P)(图2)
3.3知母皂苷AIII对U87MG细胞中p21mRNA的影响经知母皂苷AIII处理4h后,p21基因水平的表达呈剂量依赖性提高(P)(图3)
3.4Westernblot法检测知母皂苷AIII对U87MG细胞中βCatenin,CyclinD1,p21,Bcl2,pERK,TERK,pp38,Tp38,pJNK,TJNK蛋白水平的影响经知母皂苷AIII处理6h后,p21的蛋白表达上调(P),与其基因水平的变化一致。而βCatenin,Bcl2,CyclinD1经干预后下调(P)(图4)。经知母皂苷AIII处理30min后,ERK蛋白磷酸化水平显著降低(P),而p38和JNK蛋白的磷酸化水平显著升高(P)(图5)。
3.5Westernblot法检测联用SP和SB对知母皂苷AIII干预p21和βCatenin蛋白水平的影响细胞分为空白对照组、知母皂苷AIII处理组(5,10μmol·L-1)、JNK抑制剂SP600(2μmol·L-1)和p38抑制剂SB(20μmol·L-1)联用组、抑制剂联用组和知母皂苷AIII共同处理组。抑制剂联用组,与空白对照组相比,不影响p21和βCatenin在U87中的蛋白表达;抑制剂联用预处理细胞1h后,知母皂苷AIII继续处理6h,抑制剂联用和AIII10μmol·L-1共同处理组与AIII10μmol·L-1剂量单独使用组相比,p21的蛋白表达显著下调,βCatenin显著上调,逆转了AIII处理后提高p21和降低βCatenin的蛋白变化趋势(图6)。
3.6Westernblot法检测细胞核和细胞质中对知母皂苷AIII干预βCatenin蛋白水平的影响经知母皂苷AIII处理6h后,知母皂苷AIII处理组与空白对照组共同进行细胞核和细胞质蛋白的分离,检测核质内βCatenin蛋白的表达变化。U87MG细胞经AIII干预后,βCatenin的核蛋白表达显著降低(图7)。在AIII10μmolL-1剂量处理组中,该组的细胞核内βCatenin的蛋白表达相比于空白对照组有显著下降(P)。而细胞质中的βCatenin蛋白表达与空白对照组相比无显著变化。
4、结果与讨论
Wnt/βCatenin信号通路与肿瘤发生等多种疾病的病理过程相关,在多个细胞过程(分化、迁移、极性和增殖)中发挥重要作用。在胶质瘤组织中,WNT1表达比正常脑组织显著提高,并与CyclinD1的表达显著相关。Kailiang等基于UCSC癌症基因数据库分析发现βCatenin和CyclinD1在人脑胶质瘤细胞中呈高表达状态[12]。βCatenin作为核转运受体,通过与黏附分子相互作用,获得协调核功能和细胞黏附的属性[13]。熊果酸可通过降低βCatenin的核转移干预Wnt/βCatenin信号通路而抑制骨肉瘤的生长[14]。在本研究中,经知母皂苷AIII处理后,U87MG细胞中βCatenin,CyclinD1和Bcl2的蛋白表达水平均呈剂量依赖性降低,且AIII10μmol·L-1能显著降低βCatenin的核转移。
周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂p21(也称为p21WAF1/CIP1蛋白)是响应于各种刺激促进细胞周期阻滞的一个因素,在转录调控调节、抑制细胞凋亡、DNA修复中发挥作用[15]。p21由p53依赖性和p53非依赖性的机制来诱导。在p53非依赖性机制中,在有些情况下,p21具有促进细胞凋亡的作用[16]。结果显示,知母皂苷AIII处理后,可于体外显著提高U87细胞中p21在基因和蛋白水平的表达。
丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)是一种广泛存在于真核生物胞浆中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由细胞外信号引发细胞核内反应的一条经典通路,影响着细胞形成、分化、生长、增殖及凋亡等多个生命过程。研究表明有4条信号通路存在于MAPK家族中:ERK(extracellularsignalregulatedkinase)即细胞外信号调节激酶、JNK(cJunNterminalkinase)即cJunN端激酶、MAPKp38和ERK5/BMK1通路。在哺乳动物中,MKK4(MAP2K4)和MKK7(MAP2K7)磷酸化并激活JNK,而MKK3(MAP2K3),MKK4,MKK6和(MAP2K6)激活p38[17]。ERK是肿瘤细胞成瘾性基因,ERK信号通路与细胞增殖生长密切相关[18]。JNK和p38调节细胞存活(如Bcl2和Bax),细胞周期(如P53和CyclinD1)和细胞增殖(如JUN和MYC)众多基因的表达[17]。JNK通路参与知母皂苷AIII对人黑色素瘤A细胞[19]和白血病HL60[1]诱导凋亡作用。本实验结果表明,知母皂苷AIII呈剂量依赖性降低U87MG细胞中ERK蛋白的磷酸化,同时呈剂量依赖性提高p38和JNK的磷酸化水平。联用JNK抑制剂SP(2μmol·L-1)和p38抑制剂SB(20μmol·L-1)可逆转知母皂苷AIII在10μmol·L-1剂量对p21蛋白的提升作用和对βCatenin的抑制作用,而抑制剂联用组对p21和βCatenin的蛋白表达的影响,与对照组相比无统计学差异,结果提示JNK和p38信号通路参与知母皂苷AIII抑制U87MG细胞增殖的进程。
综上所述,知母皂苷AIII部分通过MAPK和Wnt/βCatenin信号通路,提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平,抑制ERK蛋白的磷酸化水平,抑制βCatenin的核转移,提高p21和抑制Bcl2,CyclinD1等抗凋亡蛋白的表达,从而抑制人脑胶质瘤细胞U87MG的体外增殖和体内生长。
参考文献：略
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